Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası arasındakı əsas fərq ondan ibarətdir ki, Qızıl Qapı klonlanmaq üçün müəyyən bir ardıcıllıq daxilində məhdudiyyət saytlarının mövcudluğuna əsaslanır, Gibson Assambleyası isə müəyyən bir ardıcıllıq daxilində məhdudiyyət saytlarının mövcudluğuna etibar etmir. klonlaşdırılsın.
Son onilliklər ərzində molekulyar elm adamları çoxlu DNT fraqmentlərinin bir parçaya daha asan yığılmasına imkan verən müxtəlif standartlaşdırılmış prosedurlar hazırlayıblar. Buna görə də, Məhdudlaşdırıcı fermentlərin bağlanması, Gateway Klonlaşdırılması, Gibson Assambleyası, Qızıl Qapı Assambleyası və TOPO Klonlaşdırılması kimi klonlaşdırma üsulları tədqiqatçılar tərəfindən elmi təcrübələrdə geniş istifadə olunur. Buna görə də, Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası çoxsaylı DNT fraqmentlərinin bir parçaya yığılmasına imkan verən iki molekulyar klonlama üsuludur.
Golden Gate Assambleyası nədir?
Qızıl Qapı çoxlu DNT fraqmentlərinin tək parçaya yığılmasını asanlaşdıran molekulyar klonlaşdırma üsuludur. Bu üsul klonlaşdırılacaq müəyyən ardıcıllıqda məhdudlaşdırıcı saytların mövcudluğuna əsaslanır. O, 1996-cı ildə yaranmışdır. Bu texnika Tip IIS məhdudlaşdırıcı fermentlərdən və T4 DNT liqazından istifadə edir. Bu fermentlər DNT-ni tanınma yerlərindən kənarda kəsir. Onlar qeyri-palindromik çıxıntılar yarada bilərlər. Buna görə də, DNT-nin çoxlu fraqmentləri aşırım ardıcıllığının birləşmələrindən istifadə etməklə yığıla bilər.
Şəkil 01: Qızıl Qapı
Golden Gate Montaj Proseduru
Golden Gate texnikasının prosedurunda üç əsas addım var:
- klonlama vektorunda kənarların yaradılması,
- aşıntılarda fraqmentə məxsus ardıcıllıqlardan istifadə etməklə çoxlu DNT əlavələrinin yığılması və
- liqasiya.
Golden Gate montajı dairəvi klonlama vektorlarından istifadə edir (təyinat vektoru). Bundan əlavə, bu üsulda həzm və bağlamanı eyni vaxtda həyata keçirmək üçün məhdudlaşdırma yeri bağlanmış məhsuldan çıxarılır. Golden Gate üçün tipik istilik dövrü protokolu 37 °C və 16 °C arasında salınır, çünki 37 °C məhdudlaşdırıcı fermentlər üçün optimaldır və 16 °C liqazlar üçün optimaldır.
Gibson Assembly nədir?
Gibson Assembly çoxlu DNT fraqmentlərinin tək parçaya yığılmasına imkan verən molekulyar klonlama üsuludur. Qızıl Qapı metodundan fərqli olaraq, bu üsul klonlaşdırılacaq müəyyən bir ardıcıllıq daxilində məhdudlaşdırma sahələrinin mövcudluğuna etibar etmir. Onu J. Craig Venter İnstitutundan Daniel G. Gibson tapıb. Bu texnika ardıcıllıq və liqazdan asılı olmayan klonlaşdırma (SLIC) metodunun bir növüdür.
Şəkil 02: Gibson Assambleyası
Gibson Montaj Proseduru
Gibson Assambleyasına bitişik DNT fraqmentləri ilə üst-üstə düşən 20-40 əsas cütü olan DNT fraqmentləri lazımdır. Üst-üstə düşmələr PCR vasitəsilə əlavə olunur. Sonra bu DNT fraqmentləri üç fermenti olan Gibson maser qarışığına əlavə edilir. Bu prosedur izotermik şəraitdə (1 saat ərzində 50 °C) üç müxtəlif fermentdən istifadə etməklə həyata keçirilir: ekzonükleaza, DNT polimeraza və DNT liqaza. Eksonükleaz DNT-ni 5' ucundan geri çeynəyir. Beləliklə, polimeraz fəaliyyətini maneə törətmir və reaksiyanın bir prosesdə davam etməsinə imkan verir. Bitişik DNT fraqmentlərində yaranan tək zəncirli bölgələr üst-üstə düşən ardıcıllıqlara görə tavlana bilər. DNT polimeraza nukleotidlər əlavə edərək boşluqları doldurur. Nəhayət, DNT liqazı kovalent şəkildə bitişik seqmentlərin DNT-si ilə birləşir. Adətən Gibson Assembly xətti təyinat vektorlarından istifadə edir. Üstəlik, bu üsul ardıcıllıq oxşarlığına əsaslanaraq eyni vaxtda 15-ə qədər DNT fraqmentini birləşdirə bilər.
Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası arasındakı oxşarlıqlar
- Golden Gate və Gibson Assembly iki molekulyar klonlama üsuludur.
- Hər iki üsul birdən çox DNT fraqmentini bir parçaya yığa bilər.
- Bu üsullar təyinat vektorlarından istifadə edir.
- Hər iki üsul çoxlu DNT fraqmentlərinin yığılması üçün termal dövranlardan istifadə edir.
- Onlar sahəyə yönəldilmiş mutagenezdə istifadə olunur.
Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası Arasındakı Fərq
Golden Gate çoxlu DNT fraqmentlərinin tək parçaya yığılmasında istifadə edilən molekulyar klonlaşdırma üsuludur və klonlanacaq müəyyən ardıcıllıqda məhdudlaşdırma sahələrinin mövcudluğuna əsaslanır, Gibson Assembly isə molekulyar klonlama üsuludur. klonlaşdırılacaq müəyyən ardıcıllıq daxilində məhdudlaşdırıcı yerlərin mövcudluğuna əsaslanmadan çoxlu DNT fraqmentlərinin tək parçaya yığılması. Bu, Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası arasındakı əsas fərqdir. Bundan əlavə, Qızıl Qapı metodu dairəvi təyinat vektorundan, Gibson Assembly metodu isə xəttiləşdirilmiş təyinat vektorundan istifadə edir.
Aşağıdakı infoqrafika Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası arasındakı fərqi cədvəl edir.
Xülasə – Qızıl Qapıya qarşı Gibson Assambleyası
Molekulyar klonlaşdırma rekombinant DNT molekullarını toplamaq və onların replikasiyasını ev sahibi orqanizmlər daxilində yönləndirmək üçün istifadə edilən üsuldur. Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası çoxlu DNT fraqmentlərinin bir parçaya yığılmasına imkan verən iki molekulyar klonlama üsuludur. Qızıl Qapı metodu klonlanacaq müəyyən ardıcıllıq daxilində məhdudlaşdırma sahələrinin mövcudluğuna əsaslanır, Gibson Assambleyası isə klonlaşdırılacaq xüsusi ardıcıllıq daxilində məhdudlaşdırıcı saytların mövcudluğuna etibar etmir. Beləliklə, Qızıl Qapı və Gibson Assambleyası arasındakı əsas fərq budur.
