Əsas Fərq – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) və Sanger Sequencing, zaman ərzində inkişaf etdirilən iki növ nukleotid ardıcıllığı texnikasıdır. Sanger Sequencing metodu uzun illər geniş şəkildə istifadə olunurdu və NGS üstünlüklərinə görə bu yaxınlarda onu əvəz etdi. NGS və Sanger Sequencing arasındakı əsas fərq ondan ibarətdir ki, NGS bir sıralama sistemi vasitəsilə eyni vaxtda sürətli bir şəkildə milyonlarla ardıcıllığın ardıcıllığı prinsipi üzərində işləyir, Sanger Sequencing isə dideoksinukleotidlərin DNT polimeraza fermenti tərəfindən selektiv daxil edilməsi səbəbindən zəncirin dayandırılması prinsipi üzərində işləyir. DNT replikasiyası zamanı və nəticədə kapilyar elektroforezlə fraqmentlərin ayrılması.
Nükleotid ardıcıllığı nədir?
Genetik məlumat orqanizmin DNT və ya RNT-nin nukleotid ardıcıllığında saxlanılır. Müəyyən bir fraqmentdə (gen, gen klasterində, xromosomda və tam genomda) nukleotidlərin düzgün ardıcıllığının (dörd əsasdan istifadə etməklə) müəyyən edilməsi prosesi nukleotid ardıcıllığı kimi tanınır. Genlərin quruluşunu və funksiyasını təhlil etmək genomik tədqiqatlar, məhkəmə ekspertizası, virusologiya, bioloji sistematik, tibbi diaqnostika, biotexnologiya və bir çox başqa sahələrdə çox vacibdir. Alimlər tərəfindən hazırlanmış müxtəlif növ ardıcıllıq üsulları var. Onların arasında 1977-ci ildə Frederik Sanqer tərəfindən hazırlanmış Sanger ardıcıllığı, Next Generation Sequencing onu əvəz edənə qədər uzun müddət geniş şəkildə istifadə edilmiş və populyarlaşmışdır.
NGS nədir?
Next Generation Sequencing (NGS) müasir yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı proseslərinə istinad etmək üçün istifadə edilən termindir. Bu, genomik tədqiqatlar və Molekulyar Biologiyada inqilab edən bir sıra müxtəlif müasir ardıcıllıq texnologiyalarını təsvir edir. Bu üsullar Illumina sequencing, Roche 454 sequencing, Ion Proton sequencing və SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) ardıcıllığıdır. NGS sistemləri daha sürətli və daha ucuzdur. NGS sistemlərində dörd əsas DNT sıralama metodundan istifadə olunur, yəni; pirosekvensiya, sintez yolu ilə ardıcıllıq, liqasiya ilə ardıcıllıq və ion yarımkeçirici ardıcıllığı. Çox sayda DNT və ya RNT zəncirləri (milyonlarla) paralel olaraq sıralana bilər. Bu, daha çox vaxt tələb edən Sanger ardıcıllığından fərqli olaraq, qısa müddət ərzində orqanizmlərin bütün genomunun ardıcıllığına imkan verir.
NGS adi sıralama Sanger metodu ilə müqayisədə bir çox üstünlüklərə malikdir. Bu, kiçik bir nümunə ölçüsü ilə həyata keçirilə bilən yüksək sürətli, daha dəqiq və sərfəli bir prosesdir. NGS metagenomik tədqiqatlarda, əlavələr və silinmələr səbəbindən fərdi genom daxilində variasiyaların aşkarlanmasında və gen ifadələrinin təhlilində istifadə edilə bilər.
Şəkil_1: NGS Sequencing-də inkişaflar
Sanger Sequencing nədir?
Sanger Sequencing 1977-ci ildə Frederik Sanqer və həmkarları tərəfindən verilmiş DNT fraqmentinin dəqiq nukleotid sırasını təyin etmək üçün hazırlanmış ardıcıllıq üsuludur. O, həmçinin zəncirin dayandırılması ardıcıllığı və ya Dideoksi ardıcıllığı kimi tanınır. Bu metodun iş prinsipi DNT-nin replikasiyası zamanı DNT polimeraza tərəfindən ddGTP, ddCTP, ddATP və ddTTP kimi zənciri bitirən dideoksinukleotidlərin (ddNTP) seçici daxil edilməsi ilə zəncir sintezinin dayandırılmasıdır. Normal nukleotidlərdə zəncir əmələ gəlməsini davam etdirmək üçün bitişik nukleotidlər arasında fosfodiester bağının əmələ gəlməsi üçün 3' OH qrupları var. Bununla belə, ddNTP-lərdə bu 3' OH qrupu yoxdur və nukleotidlər arasında fosfodiester bağları yarada bilmirlər. Beləliklə, zəncir uzanması dayandırılır.
Bu üsulda ardıcıllaşdırılacaq tək zəncirli DNT in vitro DNT sintezi üçün şablon zəncir kimi xidmət edir. Digər tələblər oliqonukleotid primeri, deoksinukleotid prekursorları və DNT polimeraza fermentidir. Hədəf fraqmentin yan ucları məlum olduqda, primerlər asanlıqla DNT replikasiyası üçün hazırlana bilər. Dörd ayrı boruda dörd ayrı DNT sintez reaksiyası həyata keçirilir. Hər bir boru digər tələblərlə birlikdə ayrıca ddNTP-lərə malikdir. Xüsusi nukleotiddən dNTP və ddNTP qarışığı əlavə edilir. Eyni şəkildə, dörd qarışıq ilə dörd boruda dörd ayrı reaksiya aparılır. Reaksiyalardan sonra DNT fraqmentlərinin aşkarlanması və fraqment nümunəsinin ardıcıllıq məlumatına çevrilməsi həyata keçirilir. Nəticədə DNT fraqmentləri istiliklə denatürasiya olunur və gel elektroforezi ilə ayrılır. Əgər radioaktiv nukleotidlərdən istifadə edilərsə, poliakrilamid geldəki bantlanma nümunəsi avtoradioqrafiya ilə görüntülənə bilər. Bu üsul flüoresanla işarələnmiş dideoksinukleotidlərdən istifadə etdikdə, o, gel oxunuşuna qədər azaldıla və flüoresan detektor tərəfindən aşkar edilmək üçün lazer şüasından keçirilə bilər. Ardıcıllığın gözlə oxunması və kompüterə əl ilə daxil edilməsi zamanı yarana biləcək xətaların qarşısını almaq üçün bu üsul kompüterlə birlikdə avtomatlaşdırılmış ardıcıllığın istifadəsinə çevrildi.
Bu, İnsan Genomu layihəsindən DNT ardıcıllığı üçün istifadə edilən üsuldur. Bu üsul hələ də qabaqcıl modifikasiyalarla istifadə olunur, çünki bahalı və yavaş proses olmasına baxmayaraq dəqiq ardıcıllıq məlumatı verir.
Şəkil_2: Sanger Sıralaması
NGS və Sanger Sequencing arasındakı fərq nədir?
NGS vs Sanger Sıralaması |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) müasir yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı proseslərinə aiddir. O, bir sıra müxtəlif müasir ardıcıllıq texnologiyalarını təsvir edir | Sanger Sequencing müəyyən DNT fraqmentinin dəqiq nukleotid sırasını təyin etmək üçün Frederik Sanqer tərəfindən hazırlanmış ardıcıllıq metodudur. |
| Xərc Effektivliyi | |
| NGS daha ucuz prosesdir, çünki o, vaxtı, insan gücünü və kimyəvi maddələri azaldır. | Bu bahalı prosesdir, çünki vaxt, insan gücü və daha çox kimyəvi maddələr tələb edir. |
| Sürət | |
| Bir çox tellərin kimyəvi aşkarlanması və siqnal aşkarlanması paralel baş verdiyi üçün bu daha tezdir. | Kimyəvi aşkarlama və siqnalın aşkarlanması iki ayrı proses kimi baş verdiyindən və yalnız teldə eyni anda oxuna biləcəyi üçün bu çox vaxt aparır. |
| Etibarlılıq | |
| NGS etibarlıdır. | Sanger ardıcıllığı daha az etibarlıdır |
| Nümunə Ölçüsü | |
| NGS daha az miqdarda DNT tələb edir. | Bu üsul böyük miqdarda şablon DNT tələb edir. |
| Bir Ardıcıl Fraqment üzrə DNT Əsasları | |
| Bir ardıcıl fraqmentə düşən DNT əsaslarının sayı Sanger metodundan azdır | Yaradıcı ardıcıllıqlar NGS ardıcıllıqlarından daha uzundur. |
Xülasə – NGS vs Sanger Sequencing
NGS və Sanger Sequencing, Molekulyar Biologiyada geniş şəkildə istifadə edilən nukleotid ardıcıllığı üsullarıdır. Sanger ardıcıllığı NGS ilə əvəz edilmiş erkən ardıcıllaşdırma üsuludur. NGS və Sanger Sequencing arasındakı əsas fərq, NGS-nin Sanger ardıcıllığına nisbətən yüksək sürətli, daha dəqiq və sərfəli proses olmasıdır. Hər iki üsul Genetika və Biotexnologiyada böyük epidemiyalar yaratdı.
