Əsas Fərq – Şimal və Cənub və Qərb Blotting
DNT, RNT və zülalların xüsusi ardıcıllığının aşkarlanması Molekulyar biologiyada müxtəlif növ tədqiqatlar üçün vacibdir. Gel elektroforezi DNT, RNT və zülalları ölçülərinə görə ayıran bir üsuldur. Gel profillərindən, xüsusi DNT ardıcıllığı, RNT ardıcıllığı və ya zülal etiketli zondlarla ləkələmə və hibridləşdirmə adlanan xüsusi üsullarla aşkar edilir. Cənub, şimal və qərb kimi üç fərqli üsul var. Şimal cənub və qərb ləkələri arasındakı əsas fərq nümunədən aşkar etdiyi molekulun növü ilə bağlıdır. Southern blotting, bir DNT nümunəsindən müəyyən bir DNT ardıcıllığını aşkar edən bir üsuldur. Northern blotting, bir RNT nümunəsindən müəyyən bir RNT ardıcıllığını aşkar edən bir texnikadır. Western blotting zülal nümunəsindən spesifik zülal aşkarlayan üsuldur.
Soutern Blotting nədir?
Southern blotting texnikası 1975-ci ildə E. M. Southern tərəfindən bir DNT nümunəsindən spesifik DNT ardıcıllığının identifikasiyası üçün hazırlanmışdır. Bu molekulyar biologiyada tətbiq edilən ilk ləkələmə üsuludur. Bu, DNT-dən spesifik genlərin, DNT-dən spesifik fraqmentlərin və s. aşkarlanmağa imkan verdi. Southern blotting texnikasında bir neçə addım var. Onlar aşağıdakılardır.
- DNT nümunədən təcrid olunur və məhdudlaşdırıcı endonükleazlarla həzm olunur.
- Həzm olunan nümunə agaroza gel elektroforezi ilə ayrılır.
- Geldəki DNT fraqmentləri qələvi məhluldan istifadə etməklə tək zəncirlərə denatürasiya edilir.
- Tək zəncirli DNT kapilyar köçürmə yolu ilə nitroselüloz filtr membranına köçürülür.
- Transfer edilmiş DNT membrana daimi olaraq sabitlənir.
- Membrandakı sabit DNT etiketli zondlarla hibridləşdirilmişdir.
- Bağlı olmayan DNT yuyulmaqla membrandan yuyulur.
- Rentgen filmi membrana məruz qalır və avtoradioqraf hazırlanır.
Southern blotting molekulyar biologiyanın müxtəlif aspektləri üçün tətbiq edilir. O, RFLP xəritəsində, məhkəmə-tibbi araşdırmalarda, gen ifadəsində DNT metilasiyası, genetik pozğunluqlarda mutasiyaya uğramış genlərin aşkarlanması, DNT barmaq izi və s. işlərində faydalıdır.
Şəkil 01: Southern Blotting Technique
Northern Blotting nədir?
Northern blotting, gen ifadəsini öyrənmək üçün nümunədən xüsusi RNT ardıcıllığını və ya mRNA ardıcıllığını aşkar etmək üçün nəzərdə tutulmuş bir üsuldur. Bu texnika 1979-cu ildə Alwine, Kemp və Stark tərəfindən işlənib hazırlanmışdır. O, sourthern və western blotting texnikalarından bir neçə mərhələyə görə fərqlənir. Bununla belə, bu texnika həmçinin gel elektroforezi, ləkələmə və xüsusi etiketli zondlar və aşkarlama ilə hibridləşdirmə yolu ilə həyata keçirilir. Northern blotting texnikası aşağıdakı kimi həyata keçirilir.
- RNT nümunədən çıxarılır və gel elektroforezi ilə ayrılır.
- RNT geldən ləkələmə membranına köçürülür və bərkidilir.
- Membran cDNA və ya RNT-dən hazırlanmış etiketli zondla müalicə olunur (zond nümunədəki xüsusi ardıcıllığı tamamlayır).
- Sond xüsusi ardıcıllıqla bağlanmaq üçün membranla inkubasiya edilir.
- Bağlı zondlar yuyulur.
- Hibridləşdirilmiş fraqmentlər avtoradioqraf tərəfindən aşkar edilir.
Northern blotting, hibridləşdirilmiş mRNT-nin aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsində, RNT deqradasiyasının öyrənilməsində, RNT yarı ömrünün qiymətləndirilməsində, RNT-nin birləşdirilməsinin aşkarlanmasında, gen ifadəsinin öyrənilməsində və s. üçün mühüm vasitədir.
Şəkil 02: Northern Blotting
Western Blotting nədir?
Western blotting, etiketli antikorun istifadəsi ilə zülal qarışığından xüsusi zülalın aşkarlanması üsuludur. Buna görə də western blot immunoblot kimi də tanınır. Bu texnika 1979-cu ildə Towbin və digərləri tərəfindən təqdim edilmişdir və hazırda laboratoriyalarda protein analizi üçün müntəzəm olaraq həyata keçirilir. Addımlar aşağıdakı kimidir.
- Zülallar nümunədən çıxarılıb
- Zülallar poliakrilamid gel elektroforezi ilə ölçülərinə görə ayrılır
- Ayrılmış molekullar elektroporasiya yolu ilə PVDF membranına və ya nitroselüloz membrana köçürülür
- Membran antikorlarla qeyri-spesifik birləşmə üçün bloklanıb
- Köçürülmüş zülallar birincil antikorla (ferment etiketli antikorlar) bağlanır.
- Qeyri-spesifik bağlanmış ilkin antikorları çıxarmaq üçün membran yuyulur
- Bağlı antikorlar substrat əlavə edilərək və əmələ gələn rəngli çöküntü aşkar edilərək aşkarlanır
Western blotting insan zərdab nümunəsində HİV əleyhinə anticisimlərin aşkarlanmasında faydalıdır. Western blot həmçinin Hepatit B infeksiyası üçün təsdiqedici test və dəli dana xəstəliyi üçün qəti test kimi istifadə edilə bilər.
Şəkil 03: Western Blotting
Şimal Cənub və Qərb Blotting arasındakı fərq nədir?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Molekulun Növü Aşkarlandı | |
| Northern Blotting | Northern blotting RNT nümunəsindən spesifik RNT ardıcıllığını aşkarlayır. |
| Southern Blotting | Southern blotting DNT nümunəsindən spesifik DNT ardıcıllığını aşkarlayır. |
| Western Blotting | Western blotting zülal nümunəsindən spesifik zülal aşkarlayır. |
| Gelin növü | |
| Northern Blotting | Bu, agaroza/formaldehid gelindən istifadə edir. |
| Southern Blotting | Bu, agaroza gelindən istifadə edir. |
| Western Blotting | Bu, Poliakrilamid geldən istifadə edir. |
| Bloklama Metodu | |
| Northern Blotting | Bu kapilyar köçürmədir. |
| Southern Blotting | Bu kapilyar köçürmədir. |
| Western Blotting | Bu elektrik transferidir. |
| İstifadə olunan problar | |
| Northern Blotting | cDNA və ya RNT zondları radioaktiv və ya radioaktiv olaraq etiketlənmişdir. |
| Southern Blotting | DNT zondları radioaktiv və ya qeyri-radioaktiv olaraq etiketlənir. |
| Western Blotting | İlkin antikorlar zond kimi istifadə olunur. |
| Algılama Sistemi | |
| Northern Blotting | Bu, avtoradioqrafdan və ya işıq və ya rəng dəyişikliyinin aşkarlanmasından istifadə etməklə edilir. |
| Southern Blotting | Bu, avtoradioqraf, işıq və ya rəng dəyişikliyinin aşkarlanması ilə edilir. |
| Western Blotting | Bu, işıq və ya rəng dəyişikliyinin aşkarlanmasından istifadə etməklə edilir. |
Xülasə – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting nümunələrdən spesifik DNT, RNT və ya zülalın identifikasiyası üçün hazırlanmış xüsusi texnikadır. Müəyyən bir molekul növünü aşkar etmək üçün üç ayrı blotting proseduru var, yəni şimal, cənub və qərb. Northern blotting texnikası RNT qarışığından müəyyən bir RNT ardıcıllığını aşkar etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Southern blotting texnikası DNT nümunəsindən spesifik DNT ardıcıllığının aşkarlanmasına imkan verir və vestern blotting texnikası zülal qarışığından spesifik zülalı müəyyən etmək üçün işlənib hazırlanıb.
