Əsas Fərq – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNT ardıcıllığı DNT analizi üçün çox vacibdir, çünki müəyyən bir DNT bölgəsində düzgün nukleotid düzülüşünə dair bilik bu barədə bir çox vacib məlumatları ortaya qoyur. Müxtəlif DNT sıralama üsulları var. Sanger ardıcıllığı və Pyrosequencing, Molekulyar Biologiyada geniş istifadə olunan iki fərqli DNT ardıcıllığı üsuludur. Sanger ardıcıllığı ilə Pyrosequencing arasındakı əsas fərq ondan ibarətdir ki, Sanger ardıcıllığı nukleotid ardıcıllığını oxumaq üçün DNT sintezini dayandırmaq üçün dideoksinukleotidlərdən istifadə edir, pirosequencing isə nukleotidləri daxil etməklə və tamamlayıcı ardıcıllığı oxumaq üçün ardıcıllığı sintez etməklə pirofosfat buraxılmasını aşkar edir.
Sanger Sequencing nədir?
Sanger ardıcıllığı 1977-ci ildə Frederick Sanger və onun kollecləri tərəfindən işlənib hazırlanmış birinci nəsil DNT ardıcıllığı üsuludur. O, həmçinin dideoksinukleotidlər (ddNTPs) tərəfindən zəncirin dayandırılmasına əsaslandığı üçün Zəncir Sonu Sıralaması və ya Dideoksi ardıcıllığı kimi də tanınır. Bu üsul Yeni Nəsil Sıralama (NGS) işlənib hazırlanana qədər 30 ildən çox müddət ərzində geniş şəkildə istifadə edilmişdir. Sanger sıralama texnikası düzgün nukleotid sırasını və ya müəyyən bir DNT fraqmentinin birləşdirilməsini kəşf etməyə imkan verdi. O, ddNTP-lərin seçici daxil edilməsinə və in vitro DNT replikasiyası zamanı DNT sintezinin dayandırılmasına əsaslanır. Qonşu nukleotidlər arasında fosfodiester bağının formalaşmasını davam etdirmək üçün 3' OH qruplarının olmaması ddNTP-lərin unikal xüsusiyyətidir. Beləliklə, ddNTP bağlandıqdan sonra zəncir uzanması dayandırılır və bu nöqtədən sona çatır. Sanger ardıcıllığında istifadə olunan dörd ddNTP var - ddATP, ddCTP, ddGTP və ddTTP. Bu nukleotidlər DNT-nin artan zəncirinə daxil olduqda DNT replikasiya prosesini dayandırır və müxtəlif uzunluqlarda qısa DNT-nin yaranması ilə nəticələnir. Kapilyar gel elektroforezi bu qısa DNT zəncirlərini Şəkil 01-də göstərildiyi kimi gel üzərində ölçülərinə görə təşkil etmək üçün istifadə olunur.
Şəkil 1: sintez edilmiş qısa DNT-nin kapilyar gel elektroforezi
DNT-nin in vitro replikasiyası üçün bir neçə tələb təmin edilməlidir. Bunlar DNT polimeraza fermenti, şablon DNT, oliqonukleotid primerləri və deoksinukleotidlərdir (dNTP). Sanger sıralamasında DNT replikasiyası dörd ayrı test borusunda dörd növ ddNTP ilə birlikdə həyata keçirilir. Deoksinukleotidlər müvafiq ddNTP-lərlə tamamilə əvəz olunmur. Xüsusi dNTP-nin qarışığı (məsələn, dATP + ddATP) boruya daxil edilir və təkrarlanır. Dörd ayrı boru məhsulu dörd ayrı quyuda bir gel üzərində işləyir. Sonra geli oxumaqla ardıcıllığı Şəkil 02-də göstərildiyi kimi qurmaq olar.
Şəkil 02: Sanger ardıcıllığı
Sanger ardıcıllığı molekulyar biologiyanın bir çox sahələrində kömək edən mühüm texnikadır. İnsan genomu layihəsi Sanger ardıcıllığına əsaslanan metodların köməyi ilə uğurla tamamlandı. Sanger ardıcıllığı, həmçinin hədəf DNT ardıcıllığı, xərçəng və genetik xəstəlik tədqiqatı, gen ifadə analizi, insan identifikasiyası, patogen aşkarlanması, mikrob ardıcıllığı və s. üçün faydalıdır.
Sanger ardıcıllığının bir neçə mənfi cəhətləri var:
- Tərtib olunan DNT-nin uzunluğu 1000 baza cütündən çox ola bilməz
- Bir anda yalnız bir tel ardıcıllıqla sıralana bilər.
- Proses vaxt aparan və bahalıdır.
Buna görə də, bu problemlərin öhdəsindən gəlmək üçün zamanla yeni qabaqcıl ardıcıllıq üsulları hazırlanmışdır. Bununla belə, Sanger ardıcıllığı təxminən 850 əsas cüt uzunluğu fraqmentinə qədər yüksək dəqiqlikli nəticələrinə görə hələ də istifadə olunur.
Pyrosequencing nədir?
Pyrosequencing "sintezlə ardıcıllığa" əsaslanan yeni DNT ardıcıllığı texnikasıdır. Bu texnika nukleotidlərin birləşməsindən sonra pirofosfat buraxılmasının aşkarlanmasına əsaslanır. Proses dörd fərqli ferment tərəfindən istifadə olunur: DNT polimeri, ATP sulfurilaza, lusiferaza və apiraza və iki substrat adenozin 5' fosfosulfat (APS) və lusiferin.
Proses, primerin tək zəncirli DNT şablonu ilə bağlanması ilə başlayır və DNT polimeraza onu tamamlayan nukleotidlərin birləşməsinə başlayır. Nukleotidlər birləşdikdə (nuklein turşusunun polimerləşməsi) pirofosfat (bir-birinə bağlı iki fosfat qrupu) qrupları və enerji buraxır. Hər bir nukleotid əlavəsi ekvimolyar miqdarda pirofosfat buraxır. APS substratının iştirakı ilə pirofosfat ATP sulfurilaza tərəfindən ATP-yə çevrilir. Yaranan ATP, lusiferaza vasitəçiliyi ilə lusiferinin oksilusiferinə çevrilməsini təmin edərək, ATP-lərin miqdarına mütənasib olan miqdarda görünən işıq yaradır. İşıq bir foton aşkarlama cihazı və ya fotoçoğ altıcı tərəfindən aşkar edilir və piroqram yaradır. Apiraz ATP-ni və reaksiya qarışığına daxil olmayan dNTP-ləri parçalayır. dNTP əlavəsi bir dəfə edilir. Nukleotidin əlavə edilməsi işığın daxil olması və aşkarlanmasına görə məlum olduğundan, şablonun ardıcıllığı müəyyən edilə bilər. Piroqram Şəkil 03-də göstərildiyi kimi nümunə DNT-nin nukleotid ardıcıllığını yaratmaq üçün istifadə olunur.
Pyrosequencing tək nukleotid polimorfizminin təhlili və DNT-nin qısa uzantılarının ardıcıllığı üçün çox vacibdir. Yüksək dəqiqlik, çeviklik, avtomatlaşdırma asanlığı və paralel emal pirosekvensiyanın Sanger ardıcıllığı üsullarına nisbətən üstünlükləridir.
Şəkil 03: Pyrosequencing
Sanger Sequencing və Pyrosequencing arasındakı fərq nədir?
Sanger Sıralaması vs Pyrosequencing |
|
| Sanger ardıcıllığı DNT polimeraza və zəncirin sonlanması ilə ddNTP-lərin selektiv daxil edilməsinə əsaslanan DNT ardıcıllığı üsuludur. | Pyrosequencing, nukleotidin daxil olması zamanı pirofosfatın sərbəst buraxılmasının aşkarlanmasına əsaslanan DNT ardıcıllığı üsuludur. |
| ddNTP-dən istifadə | |
| ddNTP-lər DNT replikasiyasını dayandırmaq üçün istifadə olunur | ddNTP-lər istifadə edilmir. |
| İştirak edən fermentlər | |
| DNT polimeraza istifadə olunur. | Dörd ferment istifadə olunur: DNT polimeraza, ATP sulfurilaza, Lusiferaza və Apiraz. |
| İstifadə olunan Substratlar | |
| APS və Luciferin istifadə edilmir. | Adenozin 5' fosfosulfat (APS) və lusiferin istifadə olunur. |
| Maksimum Temperatur | |
| Bu yavaş bir prosesdir. | Bu sürətli prosesdir. |
Xülasə – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger ardıcıllığı və Pyrosequencing molekulyar biologiyada istifadə olunan iki DNT ardıcıllığı üsuludur. Sanger ardıcıllığı zəncirin uzadılmasını dayandıraraq ardıcıllıqla nukleotidlərin sırasını qurur, pirosekvensləmə isə nukleotidlərin daxil edilməsi və pirofosfatların sərbəst buraxılmasını aşkar etməklə ardıcıl olaraq nukleotidlərin dəqiq sırasını qurur. Buna görə də, Sanger ardıcıllığı ilə Pyrosequencing arasındakı əsas fərq ondan ibarətdir ki, Sanger ardıcıllığı zəncirin sonlanması ilə ardıcıllıq üzərində işləyir, pirosequencing isə sintez yolu ilə ardıcıllıq üzərində işləyir.
