Əsas Fərq – Gen Klonlaması vs PCR
Xüsusi DNT fraqmentindən DNT-nin çoxlu nüsxələrinin sintezinə DNT-nin gücləndirilməsi deyilir. İki əsas DNT gücləndirmə prosesi var, bunlar gen klonlaşdırılması və PCR. Gen klonlaması ilə PCR arasındakı əsas fərq ondan ibarətdir ki, gen klonlaması rekombinant DNT yaradaraq və ev sahibi bakteriya daxilində böyüyərək xüsusi bir genin çoxsaylı nüsxələrini in vivo istehsal edir, PCR isə təkrar dövrlərdən keçərək in vitroda xüsusi bir DNT fraqmentinin milyonlarla nüsxəsini istehsal edir. denatürasiya və sintez.
Gen Klonlama nədir?
Gen klonlaması rekombinant DNT-nin qurulması yolu ilə orqanizmin ekstraksiya edilmiş genomik DNT-sindən müəyyən bir geni tapmaq və çox altmaq üçün istifadə edilən texnikadır. Genomik DNT zülallar üçün kodlanmış minlərlə fərqli gen ehtiva edir. DNT çıxarıldıqda, daşıya biləcəyi bütün mümkün genləri ehtiva edir. Gen klonlama texnikası ümumi DNT-dən müəyyən bir genin aşkarlanmasına imkan verdi. Buna görə də gen klonlaşdırılması molekulyar biologiyada mühüm alət kimi xidmət edir.
DNT-də müvafiq genin yeri haqqında heç bir ipucu yoxdursa, gen klonlamasında orqanizmin genomik kitabxanasının yaradılması vacibdir. Genomik kitabxana aşağıdakı addımlardan istifadə etməklə hazırlanır.
Addım 1: İstədiyiniz geni ehtiva edən orqanizmdən ümumi DNT-nin çıxarılması.
Addım 2: Kiçik idarə oluna bilən fraqmentlər yaratmaq üçün çıxarılan DNT-nin həzmini məhdudlaşdırın. Bu addım məhdudlaşdırıcı endonükleazlar tərəfindən asanlaşdırılır.
Addım 3: Uyğun vektorun seçilməsi və eyni məhdudlaşdırıcı endonükleazlardan istifadə edərək vektor DNT-nin açılması. Bakterial plazmidlər adətən xarici DNT-ni daşımaq üçün vektor kimi istifadə olunur. Plazmidlər bakteriyaların içərisində yerləşən kiçik DNT dairələridir.
Addım 4: Rekombinant DNT molekulu yaratmaq üçün vektor DNT və parçalanmış DNT-nin birləşdirilməsi. Bu addım DNT liqazası tərəfindən idarə olunur.
5-ci addım: Rekombinant DNT molekullarının ev sahibi bakteriyalara köçürülməsi. Bu addım transformasiya kimi tanınır və istilik şokundan istifadə etməklə həyata keçirilir.
Addım 5: Mədəniyyət mühitində transformasiya edilmiş bakterial hüceyrələrin skrininqi. Transformasiya prosesinin sonunda transformasiya edilmiş və çevrilməmiş ana hüceyrələrin qarışıq populyasiyası əldə edilir. Maraq geninə yalnız transformasiya edilmiş ana hüceyrələr daxildir. Beləliklə, transformasiya edilmiş hüceyrələri seçmək lazımdır. Seçim, tərkibində antibiotiklər olan selektiv mühitdən istifadə etməklə aparılır. Bu seçim mühitində yalnız transformasiya edilmiş hüceyrələr böyüyür və seçimə imkan verir.
Addım 6: Gen kitabxanası yaratmaq üçün bakteriyaların yetişdirilməsi. Bu addımda transformasiya edilmiş ana hüceyrələr optimal böyümə tələblərini təmin edən təzə mədəniyyət mühitinə daxil edilir. Mədəniyyət lövhələrindəki ümumi koloniyalar həmin orqanizmin genomik kitabxanasını təmsil edir.
7-ci addım: Maraqlanan geni ehtiva edən rekombinant DNT molekulu rekombinant DNT-nin minlərlə klonlanmış fraqmentindən yoxlanılmalıdır. Bu, spesifik geni və ya həmin gendən gələn xüsusi zülal nəticələrini qeyd edən zondların istifadəsi ilə həyata keçirilə bilər.
Tərkibində bakterial koloniya olan maraqlı gen ümumi koloniyalardan müəyyən edildikdən sonra geni ehtiva edən rekombinant plazmidin milyonlarla nüsxəsini hazırlamaq mümkündür.
Gen klonlaşdırılması gen kitabxanalarının yaradılmasında, xüsusi zülalların, vitaminlərin, antibiotiklərin, hormonların istehsalında, orqanizmlərin genomlarının ardıcıllığının və xəritələşdirilməsində, məhkəmə ekspertizasında fərdlərin DNT-sinin çoxsaylı nüsxələrinin çıxarılmasında və s. üçün istifadə olunur.
Şəkil_1: Gen Klonlaması
PZR nədir?
Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR) müəyyən bir DNT fraqmentinin çoxlu sayda nüsxəsini yaradan bir texnikadır. Xüsusi bir DNT ardıcıllığının eksponensial gücləndirilməsi in vitro şəraitdə PCR ilə əldə edilir. Bu texnika Molekulyar Biologiyada çox güclü bir vasitədir, çünki o, kiçik bir DNT nümunəsini lazımlı miqdarda çoxalda bilər. PCR 1983-cü ildə Kary Mullis tərəfindən təqdim edildi və bu mükafat qazanan ixtira Molekulyar Biologiyada böyük irəliləyiş yaratdı.
PCR texnikası Şəkil 02-də göstərildiyi kimi təkrarlanan PCR reaksiyalarını izləyir. Bir PCR reaksiyası üç müxtəlif temperaturda baş verən üç əsas mərhələdən ibarətdir; 94 0C-də DNT-də qoşa zəncirlinin denaturasiyası, 68 0C-də primerlərin tavlanması və 72 0-da uzanması C. Buna görə də, PCR həyata keçirildikdə, düzgün replikasiya üçün temperaturun dəyişməsi yüksək səviyyədə saxlanmalıdır. PCR, PCR borularının içərisində bir PCR maşınında aparılır. PCR boruları şablon DNT, Taq polimeraza, primerlər, dNTP-lər və buferdən ibarət düzgün PCR qarışıqları ilə yüklənir. İki zəncirli nümunə DNT-nin tək zəncirli DNT-yə denaturasiyası tamamlayıcı əsaslar arasındakı hidrogen bağlarını 94 – 98 0C-də qırmaqla həyata keçirilir. Sonra şablon DNT-nin tək zəncirləri primerlər üçün məruz qalır. Bir cüt primer (irəli və geri) təmin edilməlidir və onlar yüksək temperaturlara dözmək üçün termostabil olmalıdırlar. Primerlər hədəf DNT fraqmentinin uclarını tamamlayan tək zəncirli qısa DNT ardıcıllığıdır. PCR-də sintetik primerlərdən istifadə olunur. Primerlər nümunə DNT-nin tamamlayıcı əsasları ilə bağlanır və yeni bir zəncir sintezini başlatır. Bu mərhələ Taq polimeraza adlı ferment tərəfindən kataliz edilir; Thermus auqaticus-dan təcrid olunmuş termostabil DNT polimeraza fermenti. Primerlər və nukleotidlər (tikinti blokları) mövcud olduqda, Taq polimeraza şablon DNT-ni tamamlayan yeni DNT zəncirini qurur. PCR proqramının sonunda gel elektroforezindən istifadə etməklə gücləndirilmiş DNT fraqmenti müşahidə edilir. Əlavə analiz tələb olunarsa, PCR məhsulu geldən təmizlənir.
PZR genetik və qazanılmış xəstəliklərin diaqnostikası və monitorinqi, cinayətkarların identifikasiyası (məhkəmə ekspertizası sahəsində), DNT-nin hədəf seqmentinin strukturunun və funksiyasının öyrənilməsi, orqanizmlərin genomlarının ardıcıllaşdırılması və xəritələşdirilməsi üçün çox faydalıdır. və s. PCR geniş tətbiq sahəsinə malik olduğundan alimlər arasında tibbi və molekulyar biologiya tədqiqat laboratoriyalarında adi laboratoriya texnikasına çevrilmişdir.
Şəkil_2: Polimeraza Zənciri Reaksiyası
Gen Klonlaması və PCR arasındakı fərq nədir?
Gen Klonlaması vs PCR |
|
| Gen klonlaşdırılması rekombinant DNT vasitəsilə xüsusi genin in vivo çoxlu nüsxələrinin yaradılması və ana bakteriyaya çevrilməsi prosesidir. | PZR texnikası təkrarlanan PCR reaksiyaları vasitəsilə in vitroda müəyyən DNT ardıcıllığının çoxsaylı nüsxələrini istehsal edir. |
| Rekombinant DNT-nin qurulması tələbi | |
| Rekombinant DNT geni tapmaq üçün istehsal olunur. | Rekombinant DNT istehsal olunmur. |
| Əməyə ehtiyac | |
| Bu proses çox əmək tələb edir. | İntensiv əmək tələb olunmur. |
| In vivo və ya In vitro proses | |
| Rekombinant DNT-nin qurulması in vitro və DNT-nin gücləndirilməsi in vivodur. | DNT-nin gücləndirilməsi tamamilə in vitroda baş verir. |
Xülasə – Gen Klonlaması vs PCR
Gen klonlaması və PCR DNT gücləndirilməsi üçün istifadə edilən iki üsuldur. PCR, rekombinant DNT və ev sahibi orqanizmdən istifadə etmədən müəyyən bir DNT fraqmentinin DNT-nin çoxlu surətini çıxaran in vitro prosesdir. Gen klonlaşdırılması, ilk növbədə, rekombinant DNT-nin qurulması yolu ilə ev sahibi orqanizmdə maraqlı genin çoxsaylı nüsxələri ilə nəticələnən in vivo prosesdir. Bu, Gen klonlaması və PCR arasındakı fərqdir.
