Əsas Fərq – PCR vs DNT Sıralaması
PCR və DNT ardıcıllığı Molekulyar Biologiyada iki mühüm texnikadır. Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR) DNT fraqmentinin çoxlu sayda nüsxəsini yaradan prosesdir. DNT ardıcıllığı müəyyən bir DNT fraqmentinin nukleotidlərinin dəqiq sırası ilə nəticələnən texnikadır. Bu, PCR və DNT ardıcıllığı arasındakı əsas fərqdir. PCR DNT ardıcıllığının əsas mərhələlərindən biridir.
PZR nədir?
Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR) Molekulyar Biologiyada istifadə edilən DNT gücləndirmə texnikasıdır. Müəyyən bir DNT parçasının minlərlə və milyonlarla nüsxəsini istehsal edir. Bu üsul 1983-cü ildə Kary Mullis tərəfindən hazırlanmışdır. Bu texnikada gücləndiriləcək DNT fraqmenti şablon rolunu oynayır və DNT polimeraza fermenti PCR qarışığında mövcud olan primerə tamamlayıcı nukleotidlər əlavə edir. PCR reaksiyasının sonunda nümunə DNT-nin çoxlu nüsxəsi sintez olunur.
PZR qarışığının müxtəlif komponentləri var, o cümlədən DNT, DNT polimeraza (Taq polimeraza), primerlər (irəli və əks primerlər), nukleotidlər (DNT-nin tikinti blokları) və bufer. PCR bir PCR maşınının içərisində baş verir və düzgün PCR qarışığı maşına yüklənməlidir və düzgün proqram idarə edilməlidir. Bu texnika çox az miqdarda DNT-dən DNT-nin müəyyən bir hissəsinin minlərlə və ya milyonlarla nüsxəsini istehsal etməyə imkan verir.
PZR reaksiyaları bir gel üzərində görünən PCR məhsullarının miqdarını istehsal etmək üçün dövri şəkildə baş verir. Şəkil 01-də göstərildiyi kimi, PCR reaksiyasında üç əsas mərhələ var, yəni denaturasiya, primerin tavlanması və ipin uzadılması. Bu üç addım üç fərqli temperaturda baş verir. DNT tamamlayıcı əsaslar arasında hidrogen bağları ilə ikiqat zəncirli formada mövcuddur. Təsir etməzdən əvvəl iki zəncirli DNT bir-birindən ayrılmalıdır. Yüksək temperatur verməklə həyata keçirilir. Yüksək temperaturda cüt zəncirli DNT tək zəncirlərə denatürasiya olunur. Sonra primerlər xüsusi fraqmentin və ya DNT-nin geninin yan uclarına yaxınlaşmalıdır. Primer hədəf ardıcıllığı tamamlayan qısa bir zəncirli DNT parçasıdır. İrəli və tərs primerlər yumşalma temperaturunda denatürasiya edilmiş nümunə DNT-nin yan uclarında tamamlayıcı əsaslarla bağlanır. Astarlar istiliyə davamlı olmalıdır. Primerlər nümunə DNT ilə bağlandıqdan sonra, taq polimeraza fermenti hədəf DNT-yə tamamlayıcı olan nukleotidləri əlavə edərək yeni zəncirlərin sintezinə başlayır. Taq polimeraza Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriyadan təcrid olunmuş istiliyə davamlı fermentdir. PCR tamponu taq polimerazın fəaliyyəti üçün optimal şəraiti saxlayır. PCR reaksiyalarının bu üç mərhələsi lazımi miqdarda PCR məhsulu istehsal etmək üçün təkrarlanır. Hər bir PCR reaksiyasından sonra DNT surətinin sayı ikiqat artır. Beləliklə, PCR-də eksponensial gücləndirmə müşahidə edilə bilər. PCR məhsulları gel elektroforezi ilə müşahidə oluna bilər və sonrakı tədqiqatlar üçün təmizlənə bilər.
Şəkil 01: PCR Reaksiyasının Əsas Addımları
PCR tibbi və bioloji tədqiqatlarda dəyərli vasitədir. PCR məhkəmə tibb elmində xüsusi dəyərə malikdir, çünki o, cinayətkarların kiçik nümunələrindən tədqiqatlar üçün DNT-ni gücləndirə və məhkəmə DNT profilləri yarada bilər. PCR molekulyar biologiyanın bir çox sahələrində geniş istifadə olunur, o cümlədən genotipləşdirmə, gen klonlama, mutasiyaların aşkarlanması, DNT ardıcıllığı, DNT mikroarrayları və atalıq testi və s.
Şəkil 02: Polimeraza Zənciri Reaksiyası
DNT Sequencing nədir?
DNT ardıcıllığı müəyyən bir DNT fraqmentində nukleotidlərin – adenin, quanin, sitozin və timin-in dəqiq sırasının müəyyən edilməsidir. Genetik məlumat nukleotidlərin düzgün ardıcıllığından istifadə edərək DNT ardıcıllığında saxlanılır. Beləliklə, DNT fraqmentində nukleotidlərin dəqiq sırasını tapmaq genlərin quruluşu və funksiyası haqqında bilmək üçün çox vacibdir.
DNT ardıcıllığı protokolu müxtəlif prosesləri əhatə edir. İlk addım bir orqanizmin maraqlı DNT və ya genomik DNT-nin təcrid edilməsidir. PCR istifadə edərək (yuxarıda təsvir edildiyi kimi) DNT-nin istədiyiniz bölgəsi gücləndirilməlidir. Gücləndirilmiş PCR məhsulu gel elektroforezi ilə ayrılmalı və təmizlənməlidir. Gücləndirilmiş fraqmentlər ardıcıllıq üçün şablon kimi xidmət edir. Ardıcıllıq ya Sanger ardıcıllığı, ya da yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı üsulu ilə həyata keçirilə bilər. Sanger ardıcıllığı nəticəsində DNT fraqmentlərinin kapilyar elektroforezi tələb olunur. Düzgün nukleotid sırasının müəyyən edilməsi avtoradioqrafların əl ilə oxunması və ya avtomatlaşdırılmış DNT sıralayıcılarından istifadə etməklə həyata keçirilə bilər.
Gen ardıcıllığı İnsan genomu layihəsinə töhfə verdi və 2003-cü ildə insan genomunun xəritələşdirilməsini asanlaşdırdı. Məhkəmə ekspertizasında DNT ardıcıllığı unikal DNT ardıcıllığını göstərən və cinayətkarları müəyyən edən fərdlərin identifikasiyasına imkan verdi. Tibbdə DNT ardıcıllığı genetik və digər xəstəliklərdən məsul olan genləri aşkar etmək, qüsurlu genləri tapmaq və onları düzgün genlərlə əvəz etmək üçün istifadə edilə bilər. Kənd təsərrüfatında bəzi mikroorqanizmlərin DNT ardıcıllığı məlumatı iqtisadi cəhətdən arzu olunan xüsusiyyətlərə malik transgen məhsullar istehsal etmək üçün istifadə olunur.
Şəkil 03: DNT Sıralaması
PZR və DNT ardıcıllığı arasında fərq nədir?
PCR vs DNT Sıralaması |
|
| PZR prosesi maraqlı DNT fraqmentinin minlərlə-milyonlarla nüsxəsini yaradır. | DNT ardıcıllığı verilmiş DNT fraqmentində nukleotidlərin dəqiq sırasının müəyyən edilməsi prosesidir. |
| Nəticə | |
| PCR müəyyən bir DNT fraqmentinin minlərlə-milyonlarla nüsxəsini yaradır | Bu, müəyyən bir DNT fraqmentindəki əsasların düzgün sıralanması ilə nəticələnir. |
| ddNTP-lərin cəlb edilməsi | |
| PCR ddNTP tələb etmir. O, dNTP-lərdən istifadə edir. | DNT ardıcıllığı zəncir əmələ gəlməsini dayandırmaq üçün ddNTP-ləri tələb edir. |
Xülasə – PCR vs DNT Sıralaması
PCR və DNT ardıcıllığı Molekulyar Biologiyanın bir çox sahələrində çox vacib alətlərdir. DNT fraqmentlərinin gücləndirilməsi PCR texnikası ilə həyata keçirilir, DNT fraqmentinin nukleotidlərinin düzgün sırası isə DNT ardıcıllığı ilə müəyyən edilir. Bu, PCR və DNT ardıcıllığı arasındakı fərqdir.
